關鍵詞：肝微粒體，藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI），細胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450），時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）

藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）是臨床上產生嚴重不良反應甚至死亡的主要原因之一，因此對DDI發生的可能性和嚴重性及其影響程度進行科學評估是十分必要的。細胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）是體內重要的藥物代謝酶，其介導的藥物相互作用評估主要包括代謝表型研究、酶誘導作用評估及酶抑制作用評估。其中，藥物對于CYP450酶的抑制作用可分為可逆性抑制（Reversible Inhibition）和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。與可逆性抑制相比，TDI會帶來更嚴重的用藥安全問題，因此逐年受到監管機構及藥物研發者的重視。本期文章主要介紹CYP酶介導的時間依賴性抑制作用評估。

一、CYP酶介導的時間依賴性抑制介紹

CYP酶介導的酶抑制是指某些化合物能抑制某種或部分CYP450代謝酶的活性，導致聯合用藥時一些藥物出現代謝減慢、清除率降低及暴露量增加的現象，從而造成安全隱患。根據抑制的機制不同，藥物對于CYP450酶的抑制作用可分為可逆性抑制（Reversible Inhibition）和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。時間依賴性抑制又稱不可逆性抑制（Irreversible Inhibition），一般是指候選藥物經CYP酶的代謝產物以共價鍵與酶形成復合物，導致酶不可逆性失活，抑制劑對酶的抑制效應在除去抑制劑后不會即刻消失，而是呈現出時間依賴的特性。

與可逆性抑制相比，時間依賴抑制（TDI）的發生會帶來更為嚴重的用藥安全問題。聯合用藥的藥物如果受到TDI的影響，可能會存在暴露量非線性增長、血藥濃度大幅升高等后果，給患者帶來嚴重的健康威脅。最著名的實例莫如抗高血壓藥米貝拉地爾（mibefradil），它是一種鈣離子T和L通道阻滯劑，上市后出現了嚴重的不良反應。最終經研究發現，米貝拉地爾是一種時間依賴性的抑制劑，對CYP3A4產生不可逆性抑制，使聯合用的其他藥物血藥濃度大幅升高，以致產生毒性，甚至造成患者死亡，也因如此，米貝拉地爾不得不從市場上退出。

由此可見，TDI所造成的影響不僅給患者帶來嚴重的健康威脅，對制藥企業也是巨大的挑戰和威脅，因此逐年受到監管機構及藥物研發者的重視。《藥物相互作用研究技術指導原則（試行）》和ICH指導原則《M12：藥物相互作用》中明確表示應進行在研藥物對7種常規的CYP同工酶CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 產生的可逆性抑制和時間依賴性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）的體外試驗評估。

二、時間依賴性抑制體外試驗評估

一般采用人肝微粒體作為體外孵育系統進行在研藥物對于CYP450酶的時間依賴性抑制評估研究。目前常規的TDI評估方法有Single-point法、IC50位移法（IC50 shift）和Kinact/Ki法。

【Single-point法】

試驗設計：一個或兩個試驗濃度(通常1uM/10uM),一個探針底物濃度；+/-NADPH預孵育一個時間點；粗糙的評估，適合早期和高通量篩選。

評價參數：相對剩余活性（% Remaining activity=（% of NC(+NADPH）/% of NC(-NADPH）)×100

評價標準：相對剩余活性＜80%，提示有潛在的TDI風險

【IC50位移法（IC50 shift）】

試驗設計：系列試驗濃度，一個探針底物濃度，+/-NADPH預孵育30min，以測定得到的IC50值進行評估；相對精準的評估，可用于進行粗略的DDI預測。

評價參數：IC50位移=IC50（30min pre-incubation,-NADPH) /IC50（30min pre-incubation,+NADPH)

評價標準：IC50位移≥1.5，提示在研藥物存在TDI。

【Kinact/Ki法】

試驗設計：系列試驗濃度，系列探針底物濃度，+/-NADPH預孵育多個時間點；精準的測定手段，可用于進行DDI的更精準預測。

評價參數：Kinact/Ki

評價標準：結合臨床PK數據，計算R2值評價臨床意義。

目前使用比較廣泛的評估TDI效應的方法為IC50 位移法，即設置系列抑制劑濃度，在加和不加NADPH的情況下于37℃進行預孵育，預孵育時間一般為30 min（也可以設置0min預孵育組作為對照）；預孵育后，加入含有NADPH的探針底物溶液，終止反應后，測定孵育液中底物代謝產物的生成量，計算在0min預孵育和30min預孵育（加和不加NADPH情況下）IC50值，比較IC50位移倍數，從而評價抑制劑是否具有時間依賴性抑制作用。

三、IPHASE時間依賴性抑制試驗數據分析

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，采用IC50位移法驗證不同抑制劑對人肝微粒體CYP3A4酶的時間依賴性抑制（TDI）作用。IPHASE技術人員將預孵育時間設定為0min和30min，抑制劑濃度分別設置為0μM、0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM。通過已知陽性底物睪酮被CYP3A4酶轉化為特異性代謝產物6β-羥基睪酮，利用液相-串聯質譜（LC-MS/MS）檢測6β-羥基睪酮的生成量進一步用于計算 IC50值。以下為結果數據分析：

1. 抑制劑無TDI作用

如圖所示，在30min預孵育后，NADPH（+）組的IC50=6.91μM，NADPH（-）組的IC50=8.76μM，IC50位移倍數=IC50(30 min princubation, -NADPH)/IC50(30 min princubation, +NADPH)=8.76/6.91=1.27 ＜1.5，且兩者相較于0 min孵育組的IC50值沒有明顯變化，表明在研藥物對于CYP3A4酶沒有TDI作用。

2.抑制劑為NADPH依賴的TDI

此圖可以明顯看出，在30min預孵育后，NADPH（+）組的IC50曲線較NADPH（-）組和0min預孵育組有明顯的左移，其IC50位移倍數=12.43/0.63=19.73＞1.5，但NADPH（-）組的IC50曲線和0min孵育組沒有明顯變化，說明在研藥物對于CYP3A4酶具有NADPH依賴的TDI作用。

3. 抑制劑為無NADPH依賴的TDI

在實際操作中，可能會遇到這樣一種情況：在30min預孵育后，NADPH（+）組的IC50曲線較NADPH（-）組并沒有明顯的左移，如上圖所示，IC50位移倍數=0.76/0.56=1.35＜1.5，似乎可以得出抑制劑對于CYP3A4酶沒有TDI作用的結論。但圖中可以明顯看到經過30min預孵育時間的NADPH（+）組和NADPH（-）組的IC50曲線較0min預孵育組的IC50曲線有明顯的左移，說明抑制劑對于CYP3A4酶的抑制作用是呈時間依賴性的，但這種抑制作用并不依賴于NADPH，也就是說，在研藥物對于CYP3A4酶具有無NADPH依賴的TDI作用。

4. 抑制劑為NADPH依賴的酶代謝

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某次試驗結束后，試驗人員在統計結果后發現，在30min預孵育后，NADPH（-）組的代謝情況和0min預孵育組的代謝情況基本一致，但NADPH（+）組的IC50曲線較0min預孵育組的IC50曲線發生了右移。針對這一“反常"情況，我們分析抑制劑對于CYP3A4酶是可逆性抑制作用，可以和底物與CYP3A4酶發生競爭性結合，并且在NADPH存在的情況下可能被微粒體中的某種酶代謝，其代謝產物并不會對CYP3A4酶產生抑制作用。抑制劑在NADPH存在的情況下經過30min預孵育后，其代謝量較0min預孵育組多，原藥本身剩余量更少，對于CYP3A4酶的抑制作用較0min預孵育組弱，因此IC50值變大，其IC50曲線發生了右移。因此，我們判斷，在該組試驗中，抑制劑可能發生了NADPH依賴的酶代謝。

5. 抑制劑為非NADPH依賴的酶代謝

如圖所示，在30min預孵育后，NADPH（-）組和NADPH（+）組的IC50曲線基本一致，但相比0min預孵育組的IC50曲線均發生了右移，該情況和上面第4種情況類似，抑制劑可能發生了酶代謝，但該代謝過程是不依賴于NADPH的。也就是說，在30min預孵育時，NADPH（-）組和NADPH（+）組的抑制劑均發生了酶代謝，且兩組間的代謝情況相似。在整個試驗過程中，30min預孵育組的抑制劑較0min預孵育組酶代謝增多，對于CYP3A4酶的抑制作用減弱，因此IC50值變大，其IC50曲線發生了右移。因此，我們判斷，在該組試驗中，抑制劑可能發生了非NADPH依賴的酶代謝。

四、IPHASE相關產品

藥物相互作用是新藥研發重要的評價標準，而CYP酶介導的時間依賴性抑制作用評估是藥物相互作用評估重要的組成部分。鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，憑借先進的設備，專業的技術人員和多年研發的經驗，開發出人、猴、犬、大鼠、小鼠、豬、兔等多個種屬純度高、活性好的肝微粒體產品，助力廣大客戶進行CYP酶介導的TDI及其他方向的研究。

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發經驗，推出了多領域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產品，望廣大科研工作者咨詢。

參考資料：

[1] 謝珊珊，王盼，郭建軍，等. 細胞色素P450酶的時間依賴性抑制研究及其在新藥研發中的作用[J]．中國新藥與臨床雜志，2013, 32(6): 419-425.

[2] ICH指導原則《M12：藥物相互作用》. 2024.

[3] NMPA. 藥物相互作用研究技術指導原則（試行）.2021.

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